Premiers résultats des analyses génétiques des excréments et poils de loup en 2003
Entre 1997 et mars 2003, 242 échantillons d'excréments de loup, d'urine ou de poils de loups ont été récoltés et soumis aux analyses génétiques. Comment sont réalisées ces analyses génétiques et sont-elles fiables ?
Après exclusion des échantillons de Vulpes vulpes, ou Canis familiaris et des échantillons qui n'ont pu aboutir au séquençage de l'ADNm, 99 échantillons ont été diagnostiqués comme étant Canis lupus, tous provenant de lignée Italienne. La 2éme étape de détermination individuelles a pu aboutir sur 83 d'entre eux.
Suite à ces analyses, réalisées par le laboratoire d'écologie alpine de Grenoble, entre 10 et 20 individus par an ont été identifiés dans les Alpes en dehors du Mercantour. En réunissant toutes les données disponibles hors Mercantour durant les 5 dernières années cumulées, 50 animaux différents ont été détectés (ce qui ne signifie absolument pas que tous étaient présents une année donnée). Seuls 7 animaux ont pu être détectés plusieurs fois d'une année sur l'autre ou d'un massif à l'autre. Cette faible proportion de «recapture génétique» s'explique probablement par les effets combinés de :
- une pression d'échantillonnage trop faible pour espérer retrouver les excréments d'un même animal plusieurs fois,
- un renouvellement peut-être important des animaux (notion de «turn over» résultante des grandes capacités de dispersion de l'espèce et d'un fort taux de mortalité associé aux populations en expansion et
- un nombre d'animaux erratiques inconnu pouvant « diluer » le taux de ré-échantillonage.
Quelques échantillons hors Mercantour restent à analyser (Cantal, Puy de dôme). Les résultats des analyses de plus de 500 échantillons récoltés dans le Mercantour depuis 1994 devraient apporter de nombreux éléments supplémentaires sur l'historique de la colonisation.
Les différentes étapes des analyses : des pertes en ligne incontournables
Les analyses génétiques comportent 2 étapes indépendantes :
- la détermination de l'espèce et de sa lignée et
- l'identification des individus.
La détermination de l'espèce et de sa lignée fait l'objet d'une extraction et amplification de l'ADN mitochondrial, et d'un sondage pour trouver ou non une séquence caractéristique de la lignée italienne, séquence qui n'est retrouvée nulle part ailleurs dans le monde. Si cette séquence n'est pas décelée, une lecture du code génétique permet d'identifier l'espèce et la lignée d'appartenance de l'échantillon par comparaison aux données issues d'une banque mondiale de dépôt de séquences d'ADN.
L'identification des individus repose sur le même principe, mais extrait et amplifie 6 portions, dites hypervariables (les microsatellites), de l'ADN du noyau de la cellule, ainsi qu'un marqueur du chromosome Y (s'il est extrait c'est un mâle, sinon c'est une femelle).
Chacune de ces 2 étapes comportent toute une série de procédures au cours desquelles peuvent survenir des pertes d'ADN, notamment au moment des différentes étapes d'amplifications et purifications. L'amplification peut fonctionner sur l'ADN mitochondrial et pas sur l'ADN du noyau. Les causes de ces pertes sont dues principalement aux très faibles quantités d'ADN retrouvées dans les crottes (cellules épithéliales du rectum collées sur les excréments). De plus, les cellules d'un échantillon ayant subit plusieurs cycles froid/chaud sont dégradées. Ainsi actuellement 1/4 des échantillons ne sont pas utilisables.
Suivi hivernal et suivi génétique : 2 méthodes aux objectifs complémentaires
Les analyses génétiques ne se substituent en aucun cas aux relevés hivernaux de traces. Chaque méthode nous renseigne sur des questions différentes : les traces servent à estimer les tailles de groupes instantanées, les analyses génétiques permettent la distinction entre 2 meutes différentes mais voisines, et d'identifier les voies de colonisation à l'échelle de l'arc alpin.
En aucun cas, les analyses génétiques ne sauraient être en l'état un dénombrement exhaustif des animaux. L'objectif est de «re-capturer » les crottes d'un même animal sur plusieurs années, pour appliquer des méthodes dites de Capture-Recapture, qui, elles, permettent d'estimer des tailles de populations. Cette démarche s'inscrit donc sur le long terme et la récolte continue des excréments (y compris dans les zones de présence connues) reste plus que jamais d'actualité.
Les résultats des profils génétiques identifiés dans les Alpes Hors Mercantour
Le tableau ci-dessus (*) (cliquez dessus pour l'agrandir) présente la répartition des différents animaux détectés par massif et par saison, avec un découpage calé sur la période de reproduction (1er juin au 31 mai).
Dans le Vercors, les 2 éléments remarquables sont qu'une même femelle (F13) est présente depuis 4 ans sur les hauts plateaux, et qu'au moins 4 animaux différents y séjournaient en 1999-2000 (reproduction, immigration ? ces 2 hypothèses seront testées avec l'établissement génétique des liens de filiations à venir). Le seul échantillon Canis lupus récolté à l'ouest du Vercors (Omblèze-Bouvante) n'est malheureusement pas exploitable au niveau de sa détermination individuelle. Les nouveaux échantillons de cette zone seront prioritaires pour savoir s'il s'agit d'animaux autres que ceux des hauts plateaux.
En Belledonne, jusqu'à 5 animaux différents ont été échantillonnés entre juin 2000 et Mai 2001 (même remarque que pour le Vercors). Les mêmes animaux sont retrouvés à Presle (73) et à la Ferrière (38), confirmant l'existence d'une seule et même meute en Belledonne. Aucun échantillon n'était disponible sur l'Oisan au 1er décembre 2001. Autre point remarquable, le loup M20 tué à Allevard était en Vanoise (Aussois) en 1999.
Sept Animaux différents étaient présents dans le Béal Traversier (05) en 2000-2001. En 2000, les sites du Queyras et du Béal n'étaient qu'une seule et même zone de présence. L'hypothèse d'une meute qui se serait scindée en 2 groupes distincts en 2001 (comme suspecté par le suivi hivernal) n'est ici pas vérifiable étant donné le faible nombre de profils génétiques individuels identifiés dans le Queyras après 2001 (pour mémoire, le suivi des traces donnait au moins 4 animaux dans le Queyras et 3 dans le Béal en 2001 et respectivement 8 et 2 animaux en 2002).
Six animaux différents ont fréquentés le massif de Monges (04) depuis 1998 (2 chaque année). Un mâle et une femelle étaient encore présents en 2001-2002.
Le même mâle M33 a été identifié à plusieurs reprises sur le plateau de Canjuers (83).
En dehors du cadre du réseau loup, des échantillons ont été collectés dans les Pyrénées Orientales et confiés à l'ONCFS : 3 animaux différents tous de lignée génétique italienne ont été identifiés sur les 4 ans de suivi (IF et lM en 1999 et lM en 2000) dans le massif de Madres (66). Un autre échantillon, envoyé par les autorités espagnoles, identifie un autre mâle, italien lui aussi. En 2002, Après 1 année d'absence d'information, une photo prise en 2002 identifie la présence de l'espèce dans les Pyrénées Orientales cette dernière année.
Globalement, 82 % des animaux n'ont été retrouvés génétiquement qu'une seule fois. Ainsi que mentionné précédemment, interpréter ce faible taux de ré-échantillonnage n'est pas chose aisée. Les populations en voie de colonisation sont souvent caractérisées par un plus fort renouvellement des individus que celles bien installées (les paramètres démographiques de fécondité, de mortalité, de dispersion étant différents). Mais avant tout, il faut s'interroger sur l'influence du dispositif d'échantillonnage, illustrée par exemple avec le cas les animaux en dispersion (exemple : M20 non retrouvé en 99-00).
Notons aussi une sexe-ratio globalement équilibrée, les hasards d'échantillonnage et/ou d'installation des individus pouvant faire apparaître quelques déséquilibres locaux.
Les identifications des animaux ayant fréquenté le Mercantour seront disponibles d'ici l'été prochain, et constitueront autant de nouveaux éléments pour mieux comprendre la dynamique de colonisation du loup dans les Alpes.
Quelle est la puissance et la fiabilité de ces analyses ?
Deux années ont été nécessaires au Laboratoire de Biologie des populations d'Altitude de Grenoble pour la mise au point méthodologique de cet outil moléculaire applicable spécifiquement au loup. L'objectif était de trouver suffisamment de marqueurs qui, combinés, rendaient maximale la probabilité de discrimination entre 2 individus, aussi proches soient-ils (frère-sœur par exemple), et ce avec un risque d'erreur minimal.
Au départ, 42 marqueurs ont été testés. Puis 6 ont été retenus, plus un marqueur situé sur le chromosome Y pour la détermination du sexe. A partir de simulations, l'ensemble de ces 7 microsatellites donne un risque de se tromper (carte d'identité similaires pour 2 animaux différents) inférieur à 1/10000 pour une population sans relation de parentés, et à l'autre extrémité, de 1/100 pour une population qui serait constituée uniquement de frères et sœurs (individus très apparentés donc très similaires dans leur composition ADN).
En moyenne, le risque d'identité entre 2 profils, alors que les animaux seraient effectivement différents, est estimé inférieur à 1 « chance» sur 1000. Ce travail de mise au point a d'ailleurs fait l'objet d'une thèse de doctorat par Nathaniel Valière au sein des Laboratoire de biologie des populations d'Altitude dirigé par P. Taberlet et de Biométrie et biologie évolutive de Lyon dirigé par D. Pontier.
Sachant qu'en génétique des populations, les normes standard de risque acceptables sont de 1 %, les résultats présents obtenus à 0,1% de risque sont donc largement fiables pour distinguer parfaitement les individus.
Encore du travail en méthodologie à l'échelle internationale
Pour toutes les raisons méthodologiques et biologiques évoquées précédemment, la probabilité de retrouver un individu à 2 endroits différents reste faible. Il faut donc essayer de retracer les relations de parenté entre individus (en remontant une, voire deux générations) pour reconstruire le scénario de la colonisation et les relations entre meutes. La détermination de ces liens de filiations nécessite un pouvoir de discrimination encore plus grand que celui dont nous disposons actuellement. Plus le degré d'apparentement entre les animaux est important, plus la carte d'identité génétique doit reposer sur un nombre de marqueurs moléculaires importants.
Aussi, les laboratoires de Grenoble (Fr), Bologne (It) et de Lausanne (Ch) travaillent actuellement sur la mise au point d'une méthodologie commune avec 12 marqueurs. Ce procédé présentera également l'avantage de pouvoir établir les liens de filiation entre les différents animaux qui vivent actuellement dans chacun des trois pays de l'Arc Alpin. Cette démarche nécessitera au moins une année de travail méthodologique avant de pouvoir donner des résultats concrets.
Extrait du Bulletin d'information du réseau loup n°10 de mars 2003
(*) Source des échantillons : Réseau loup - Analyses moléculaires : CNRS 5553 labo d'écologie alpine de Grenoble - F=femelle, M=mâle, n°= identifiant de l'individu. Total : nombre de "cartes d'identités" de loup différentes identifiées au cours du cycle biologique (juin à mai) dans un massif donné. - Attention, aucune correspondance ne peut être faite avec le suivi hivernal car des animaux peuvent être morts (ou en phase de sispersion d'automne) avant l'hiver. L'échantillonnage de la saison 2001-2002 s'arrête en décembre 2001.









